La disponibilité d'une grande quantité d’information sur les séquences d’ADN et en particulier sur les génomes complets de plus de 20 espèces bactériennes a ouvert le "troisième âge" de la microbiologie moléculaire (Tang 1997). Les recherches sur les lois de l'hérédité ont inauguré le "premier âge", celui de l'analyse de mutants aléatoires aux phénotypes intéressants. L’objectif de beaucoup de ces études était la découverte des bases moléculaires ou fonctionnelles de ces phénotypes. À la suite de la révolution moléculaire des années 50 et 60, nous sommes rentrés dans le "deuxième âge". Celui-ci a été dominé par l’application de la technologie de l’ADN recombinant à la construction de mutations dirigées sur des gènes dont on spéculait un certain phénotype. Aujourd’hui, grâce à la quantité et à l'exhaustivité des descriptions génétiques, les hypothèses sur les fonctions et rôles des gènes seront de plus en plus issues de recherches in silico, suivies par des tests au laboratoire. Si le premier âge était basé sur la connaissance du génotype par observation de différents phénotypes et si le deuxième se basait sur des changements précis des génotypes pour observer les phénotypes correspondants, on essaye maintenant de déduire des phénotypes en partant de l’information sur le génotype (Figure 2.1) (Hinton 1997).
Ainsi, nous sommes devant un changement vraiment qualitatif de la façon de rechercher en microbiologie. Ce n’est pas seulement que nous avons beaucoup plus de données, c’est aussi que nous avons la possibilité de nous poser des questions qui, il y a très peu de temps encore, ne pouvait être que des spéculations.
En provoquant une rupture de paradigme en termes de recherche en microbiologie, la contribution de la génomique n’est pas de jeter aux oubliettes les résultats et méthodes de tout ce qu’a été faite jusqu’à présent. Au contraire, une fois acquise l’information sur l’ensemble de gènes que constitue le génome, il faut bien essayer de comprendre son rôle. Ceci est l'objectif primordial des programmes d'analyse fonctionnelle en cours chez plusieurs organismes modèles tels que Bacillus subtilis (Ehrlich et al. 1999) ou Saccharomyces cerevisiae (Dujon 1996).
La génomique ne vaut pas simplement par ce qu’elle donne à connaître, mais aussi par ce qu’elle dévoile de notre ignorance sur le fonctionnement des bactéries. La constatation du fait qu'entre un tiers et la moitié des gènes présents dans les génomes bactériens a une fonction inconnue est d’importance fondamentale pour comprendre ce qu’il reste encore à découvrir. C’est cette découverte, issue de l’analyse in silico, qui est à l’origine de l’analyse exploratoire des génomes.
La rupture épistémologique créée par la génomique est profonde, puisqu’elle représente aussi la remise en question de l’approche hypothético-déductive classique en biologie expérimentale (Goodman 1999). Dans ce modèle classique de recherche, il y a une définition préalable de l’hypothèse à tester, suivie de la définition d’une expérience ayant comme objective sa confirmation ou sa négation. Les raisonnements sous-jacents à cette approche semblent assez raisonnables. Non seulement elle permet une définition objective des hypothèses, mais elle conduit généralement aussi à un bon rapport résultats/coût pour le résultat attendu. Et pourtant, c’est justement ce bon rapport qui est remis en question par la génomique. La collection de génomes complets est probablement la plus grande collection "libre d’hypothèses préalables" de l’histoire de la biologie (Goodman 1999). De plus, elle est moins coûteuse que l’approche de séquençage gène par gène (i.e. sujet par sujet) (Dujon 1996). Une fois obtenue, l’information sur le génome peut être examinée par la communauté scientifique de plusieurs façons et perspectives (Clayton et al. 1998). De plus, cette "recherche dirigée par les données" n’est pas seulement une alternative, c’est aussi une nécessité quand il n’y a pas de connaissances préalables suffisantes pour définir des hypothèses objectives et précises.
Devant un nouveau génome, le chercheur est un peu comme les explorateurs du XIVième siècle devant un nouvel océan : si on ne connaît rien, comment savoir où aller ? En fait, les hypothèses définies aujourd’hui par les chercheurs sont fondées sur une énorme masse de données acquises dans le passé. Cette situation ressemble beaucoup au travail des naturalistes du XVIIIième et XIXième siècles qui recueillaient des spécimens partout dans le monde en quête de règles et de formalisations. Dans ces deux cas, l’exploration est la seule voie. Pour les biologistes du XIXième siècle, ceci a abouti à une énorme masse de données qui, même sans d'hypothèse préalable, a été à la base des théories de l'évolution des espèces (Depew & Weber 1995).
Cependant, l’approche exploratoire a ses limites et ses dangers. Puisqu’elle est plus générale, il est plus difficile de décomposer les effets dans le tout. Il est également plus difficile de sortir du domaine de la simple description vers celui des théories et modèles.
Finalement, nous revenons à notre question d’origine : qu’est ce que la génomique ? En l’absence d'une définition dans le dictionnaire, nous pouvons la définir comme ce qui concerne l’analyse des génomes, pris comme un tout. C’est une définition assez générale, et vague en conséquence, qui a été créée en 1986 par Thomas Roderick (Hieter & Boguski 1997) pour décrire la discipline scientifique consacrée à cartographier, à séquencer et à analyser les génomes (et qui par ailleurs a été utilisée la première fois pour baptiser un journal scientifique).
Aujourd'hui la génomique est en train de se déplacer rapidement d’une vision centrée sur le séquençage vers celle de l’analyse des fonctions. Certains appellent "génomique fonctionnelle" cette seconde phase (Hieter & Boguski 1997), puisqu’on se focalise sur la fonction des gènes. En fait, il n’y a pas que la fonction des gènes qui est importante, il faut y ajouter l’évolution et l’organisation de l’information génétique. Ce n’est qu’avec ces deux autres composantes, malheureusement fréquemment oubliées dans l’exaltation de la génomique, que le tableau se complète.
Nous décrirons de façon brève, dans les prochains paragraphes, les principaux projets de séquençage de bactéries et ce qu’ils nous ont appris.
Le premier génome à ADN entièrement séquencé a été celui du bactériophage FX174 (5386 pb) en 1978 (Sanger et al. 1978). Les 17 années suivantes ont vu apparaître plusieurs autres génomes de virus, de mitochondries et de chloroplastes. Contrairement à l’attente générale Escherichia coli, le plus important des modèles bactériens, n'a pas été séquencé le premier, mais une autre protéobactérie : Haemophilus influenzae (Fleischmann et al. 1995) l’a devancé. C’était en 1995 et cette date marque le début de l’âge de la génomique bactérienne.
Les prem iers génomes
L’originalité du projet de séquençage de Haemophilus influenzae réside dans la stratégie utilisée : tout le génome a été fragmenté aléatoirement, tous les morceaux séquencés et finalement assemblés. Ce projet a démontré qu’il n'était pas nécessaire de connaître la carte physique d'un génome pour le séquencer entièrement. Cette méthode avait déjà été utilisée précédemment, mais pour des génomes beaucoup plus petits, comme le phage Lambda (Sanger et al. 1982). Au-delà de la prouesse technique, il n’y aurait pas eu de génome complet sans un fort investissement dans la création de logiciels d’assemblage des fragments. C’est en effet un problème très difficile du point de vue de l'informatique (Galant et al. 1980), qui limite encore la taille des génomes séquencés selon cette approche.
Pourtant les résultats ont confirmé les analyses des premiers chromosomes complets de S. cerevisiae (Dujon 1996) et des longs contigs de Escherichia coli (Blattner et al. 1993). En effet, la séquence de Haemophilus influenzae (1.83 Mb) contient environ 1743 gènes putatifs, parmi lesquels 40 % n’ont pas de fonction connue. La moitié de ces gènes n'ont pas d’homologues dans les bases de données, alors que l’autre moitié possède des homologues dont on ignore également la fonction (Fleischmann et al. 1995). Cette observation s’est répétée à chaque publication d’un nouveau génome, même si les chiffres précis varient suivant l’organisme et les méthodes utilisées (Tableau 1). Une actualisation des annotations de Haemophilus influenzae a permis d’assigner une fonction à 15 % de ces "gènes orphelins" qui, parfois, résultaient d'erreurs de séquençage (Clayton et al. 1998). Ce résultat démontre que l’obtention de génomes complets doit être suivie d’efforts d’actualisation des annotations et de la séquence elle-même (Moszer 1998).
Jusqu’à la parution du génome complet de Haemophilus influenzae, le séquençage de génomes bactériens ne constituait une priorité ni pour la plupart des chercheurs ni pour les agences de financement (Danchin 1995) (Tang 1997). Après sa publication, tout le domaine a été bouleversé et le séquençage de bactéries a connu un essor qui se prolonge jusqu’à nos jours. Peu après Haemophilus influenzae est paru le génome de Mycoplasma genitalium, la bactérie possédant le plus petit génome connu à l’époque (Fraser et al. 1995). La stratégie utilisée pour séquencer le génome de Mycoplasma genitalium fut identique à celle employée dans le cas de Haemophilus influenzae, mais fut facilitée par l’existence de cartes physiques et génétiques et d'études préalables de séquençage aléatoire (Peterson et al. 1993). Les 470 régions codantes prédites couvrent 88 % du génome, de manière similaire au cas de Haemophilus influenzae. Contrairement à la plupart des autres génomes, chez Mycoplasma genitalium le nombre de "gènes orphelins" n’est que de 20 %, ce qui est probablement dû à la très petite taille du génome (580 Kb) (Fraser et al. 1995) (Himmelreich et al. 1997).
La troisième bactérie entièrement séquencée a été Methanococcus jannaschii, une bactérie avec un chromosome circulaire de 1 664 kb et deux plasmides de 58 Kb et 16 Kb (Bult et al. 1996). Cette bactérie est intéressante pour plusieurs raisons : 1) c’est une archaea ; 2) elle vit dans des conditions extrêmes (94ºC et 200 atmosphères) ; 3) elle est autotrophe ; 4) elle est anaérobie stricte et 5) elle est méthanogène. Sur les 1 738 gènes prédits, seuls 38 % ont pu se voir attribuer une fonction précise, ce qui illustre de façon saisissante notre ignorance du domaine des archaea (Edgell & Doolittle 1997b).
Finalement, peu après le génome de Methanococcus jannaschii, sont sortis les derniers chromosomes de S. cerevisiae (Dujon 1996), ce qui a permis d’ajouter un eucaryote à la collection de génomes complètement séquencés. Ce génome est remarquablement compact pour un génome eucaryote, puisqu'il possède 16 chromosomes totalisant environ 12 Mb, et environ 72 % de régions codantes. S. cerevisiae possède environ 6 200 gènes putatifs, parmi lesquels 30 à 35 % n’avaient pas d’homologues dans les banques de données (Dujon 1996). Au-delà du fait que la levure est un modèle très important parmi les eucaryotes, la comparaison de ce génome avec les génomes bactériens connus à l’époque a permis l’analyse phylogénétique de génomes complets et l’approfondissement de l’étude sur l’origine des archaea (Tekaia et al. 1999). Cette séquence a également permis d’esquisser les premières études comparatives sur les différents mécanismes dans les eubactéries, les archaea et les eucaryotes (Edgell & Doolittle 1997a).
Les génomes des bactéries modèles
Le problème des génomes énumérés ci-dessus est qu’on ignore beaucoup de leur biochimie et de leur génétique. De plus, Mycoplasma genitalium et Methanococcus jannaschii poussent très difficilement en laboratoire. Il a fallu attendre jusqu’à la deuxième moitié de 1997 pour avoir enfin accès aux génomes complets des deux principaux modèles bactériens : Escherichia coli pour les protéobactéries et Bacillus subtilis pour les firmicutes (ou Gram positives).
Le génome d’Escherichia coli
L’importance de l’entérobactérie Escherichia coli provient du très grand nombre d’études génétiques, biochimiques et épidémiologiques auxquelles elle a donné lieu. Près de 500 protéines de Escherichia coli ont des structures 3D connues soit par analyse directe (rayons X ou RMN) soit par homologie. On dispose de plusieurs bases de données spécialisées sur son métabolisme, comme EcoCyc (Karp 1996) et KEGG (Kanehisa 1997). L’expressivité de ses gènes a aussi été analysée en détail et cette information est compilée dans un catalogue de gels 2D (VanBogelen et al. 1999). De plus, la famille des entérobactéries contient plusieurs des plus virulentes bactéries chez l’homme, notamment celles qui sont responsables du choléra, du typhus et de la dysenterie. La littérature sur Escherichia coli est tellement vaste qu'une recherche dans la base de données bibliographiques Medline, indique l'existence d’environ 170 000 articles citant cette espèce dans le titre ou dans le résumé. Le papier qui présente la séquence complète de cette bactérie indique l’existence de 4288 gènes putatifs (Blattner et al. 1997). En dépit de tous les travaux publiés sur cet organisme 40 % des gènes n’ont pas de fonction connue ou même putative. Les analyses du génome ont par ailleurs révélé une organisation significative, puisque les gènes fortement exprimés se trouvent plutôt au voisinage de l’origine de réplication et sur le brin précoce (Sharp et al. 1989) (Blattner et al. 1997). On observe également des biais associés à la réplication (Lobry 1996a) et l'existence d'une forte structuration en opérons, révélé par l’existence de nombreux terminateurs rho-indépendants (Carafa et al. 1990). Enfin, Ce génome contient aussi de nombreuses séquences d’insertion, de vestiges de phages et d'éléments transférés horizontalement (Médigue et al. 1991) (Lawrence & Ochman 1998).
Le génome de Bacillus subtilis
Bacillus subtilis est le mieux caractérisé des firmicutes. Son génome, d’environ 4,2 Mb, contient environ 4100 gènes, parmi lesquels 42 % n’ont pas pu être classés sur la base de l’homologie de séquence (Kunst et al. 1997). La classification de ces 4100 gènes en familles fonctionnelles, a révélé qu’environ 53 % des familles contiennent un seul gène, alors que certaines familles sont très nombreuses, la famille des ATP-transporteurs étant la plus nombreuse avec 77 gènes (Kunst et al. 1997). Au contraire de la plupart des bactéries séquencées, Bacillus subtilis n’est ni un agent infectieux ni un extrêmophile. En conséquence son génome peut apporter des informations précieuses sur les bactéries mésophiles et en particulier sur celles qui habitent le sol. Il faut préciser que le sol est le plus grand réservoir de bactéries sur la planète, il contient entre 4 et 5 ordres de grandeur de fois plus de bactéries que tous les animaux réunis (Whitman et al. 1998). L’analyse du génome de Bacillus subtilis a révélé qu’une partie importante de son information génétique intervient dans l’utilisation de différentes sources de carbone et, en particulier, des sources d'origine végétale.
Le génome de Bacillus subtilis a un contenu G+C de 43 %, de distribution hétérogène, puisqu’il présente des îlots de fort contenu A+T. Ces îlots sont associés à des prophages insérées dans le chromosome comme SPb et PBSX, à des éléments mobiles, à des régulateurs de la sporulation, comme skin, et à des régions transférées horizontalement (Kunst et al. 1997). De plus, le contenu en guanine et en cytosine est différent entre les deux brins de réplication, avec un plus grand pourcentage de guanine dans le brin précoce et de cytosine dans le brin tardif (Lobry 1996a) (Kunst et al. 1997). Cet effet provoque une très importante inversion du rapport (G-C)/(G+C) à l’origine et au terminus de la réplication.
Les (presque) doublons
En fin de 1999 presque tous les taxons bactériens sont représentés dans la banque des génomes complets, ce qui permet l’analyse des différences entre eux. Néanmoins, les microbiologistes sont souvent plus intéressés par les petites différences entre des organismes proches, voire des souches d'un même organisme. Un cas typique est celui de la virulence chez les bactéries pathogènes. Différentes souches d’un même organisme peuvent varier très significativement en termes de virulence, comme est le cas des souches de Escherichia coli O157:H7 et K12 (Plunkett et al. 1999). Fréquemment ces différences s’expliquent par l’introduction dans les génomes de cassettes de virulence (e.g. chez Salmonella tiphymurium (Groisman & Ochman 1997)) ou de plasmides porteurs de gènes de virulence (e.g. chez Shigella flexneri (Dorman & Porter 1998)). Ainsi le séquençage de génomes complets d’espèces assez proches (voire de souches d'une même espèce) a été envisagé très tôt. Aujourd’hui on possède déjà quelques cas de ces (presque) doublons.
Mycoplasma genitalium et Mycoplasma pneumoniae sont des firmicutes tellement proches que tous les gènes de Mycoplasma genitalium (le plus petit) ont un homologue chez Mycoplasma pneumoniae (Himmelreich et al. 1997). Cependant, ces génomes ont des tailles et des contenus G+C très différents, 580 kb et 32 % pour Mycoplasma genitalium (Fraser et al. 1995) et 816 kb et 40% pour Mycoplasma pneumoniae (Himmelreich et al. 1996). Les deux organismes sont pathogènes chez l’homme et dépendent de l’hôte pour l’acquisition des nutriments essentiels (Dybvig & Voelker 1996). Mycoplasma pneumoniae est souvent rencontré dans les voies respiratoires alors que Mycoplasma genitalium s’installe dans la région urogenitale (Razin et al. 1998). L’analyse comparative de ces deux génomes a permis leur subdivision en 6 segments où l’ordre des orthologues est maintenu, même si les 6 segments sont disposés différemment dans les deux génomes, probablement en raison de translocations par recombinaison homologue (Himmelreich et al. 1997). Plusieurs gènes de ces bactéries présentent des répétitions qui sont utilisées pour échapper au système immunitaire de l'hôte (Himmelreich et al. 1997) (Razin et al. 1998). On reparlera de ces répétitions au chapitre 7.
Deux autres paires d’organismes, entièrement séquencés, ont fait l'objet d'analyses comparatives : la paire Chlamydia pneumoniae et Chlamydia trachomatis (Kalman et al. 1999) et la paire Borrelia burgdorferi et Treponema pallidum (Fraser et al. 1998). Ces quatre organismes sont pathogènes chez l’homme, mais les absences de données métaboliques et d’outils génétiques rendent les comparaisons génomiques moins fructueuses. Les Chlamydiae sont des eubactéries intracellulaires obligatoires bien séparées du point de vue phylogénétique des autres groupes. Les deux Chlamydiae séquencées sont des pathogènes humains responsables de la pneumonie, la bronchite (C. pneumoniae), le trachome et plusieurs maladies sexuellement transmissibles (C. trachomatis). Le premier de ces génomes mesure 1,23 Mb et possède 1073 gènes putatifs alors que le second mesure 1,04 Mb et possède 894 gènes putatifs. Les 214 gènes qui se trouvent chez C. pneumoniae, mais pas chez C. trachomatis, ont, pour la plupart, des fonctions inconnues et manquent d’homologues dans les bases de données. On trouve dans ce groupe de gènes une famille composée de 21 variantes de protéines de la membrane extérieure (Kalman et al. 1999), soulignant une fois de plus le rôle fondamental de ces protéines dans la pathogénicité.
Les deux Spirochètes actuellement séquencés sont également des organismes pathogènes responsables de maladies assez graves : la syphilis pour Treponema pallidum et la maladie de Lyme pour Borrelia burgdorferi. La distance évolutive important entre ces deux espèces fait que bien qu'ayant des génomes de taille similaire (1,14 Mb pour T. pallidum et 911 kb pour Borrelia burgdorferi) la comparaison n'ait abouti qu'à très peu de résultats concrets (Fraser et al. 1998).
Jusqu’à présent Helicobacter pylori a été la seule espèce pour laquelle deux souches différentes ont été entièrement séquencées et publiées, la souche 26695 (1,667 Mb) (Tomb et al. 1997) et la souche J99 (1,644 Mb) (Alm et al. 1999). La petite différence entre les tailles est bien représentative de la similarité générale des deux chromosomes. L’organisation génomique, l’ordre des gènes et les protéines prédites pour les deux génomes sont très similaires, à l’exception de 6 % à 7 % des gènes qui semblent spécifiques de chaque souche (Alm et al. 1999). La moitié de ces gènes sont agrégés dans une région très variable. La comparaison des deux souches révèle aussi quelques inversions et translocations de régions associées à la recombinaison entre paralogues qui codent pour des protéines membranaires.
Quelques perspectives ouvertes par la génomique
L’arbre de la vie
On s’attendait à ce que les données issues des projets de séquençage n’aient qu'une faible influence sur notre connaissance de l’arbre du vivant. Sauf peut-être au niveau des détails, on s’attendait à voir confirmer l’arbre construit avec un nombre considérable de sous-unités 16S des ribosomes par Carl Woese et collègues (Woese et al. 1990). La comparaison des séquences d'ARNr suggérait que l’évolution à partir du dernier ancêtre commun ait d'abord créé deux branches : d’un côté les eubactéries, de l’autre côté les archaea et les eucaryotes. Ensuite, cette seconde branche aurait divergé séparant les archaea et les eucaryotes. Mais finalement l’analyse des génomes semble révéler un scénario plus complexe.
Ces analyses ont permis l’établissement d’arbres phylogénétiques pour un grand nombre de gènes. Fréquemment ces arbres ne sont pas concordants (Harvey et al. 1996). La raison sous-jacente à beaucoup de ces incongruités réside peut être dans l’utilisation abusive des méthodes de reconstruction (Philippe & Laurent 1999) ou dans le remplacement fonctionnel de paralogues par d’autres gènes (Forterre 1999). Cependant le grand nombre de cas trouvés récemment suggèrent également qu’une bonne partie de l’évolution des procaryotes se soit faite par l’acquisition horizontale de gènes. La fréquence de transfert de ces gènes semble fortement liée à leur fonction. Ainsi, sont plus fréquemment transmis tous les gènes qui peuvent donner des avantages immédiats à la bactérie comme les gènes de résistance aux antibiotiques ou les facteurs de virulence (Syvanen 1994). Par ailleurs, les gènes liés à la traduction, la transcription et la réplication (gènes d’information) sont beaucoup plus rarement transmis que les gènes liés aux fonctions métaboliques (gènes de ménage) (Rivera et al. 1998). La raison de ceci tient très probablement aux grands complexes formés par les gènes d’information et à la multitude d’interactions directes entre ces protéines (Jain et al. 1999). Ceci contraint significativement la gamme de variantes susceptible de remplacer le gène résident. A l'inverse, les protéines de "ménage" agissent typiquement seules ou en petits complexes (Jain et al. 1999). Finalement, les exemples de transfert massif de gènes entre organismes lointains comme Thermotoga maritima et plusieurs archaebactéries sont probablement dus à leur coexistence dans des environnements très hostiles (Logsdon & Faguy 1999). Si les chiffres de 24 % de gènes transférés des archaea vers cette bactérie se confirment (par rapport aux 52 % d’origine eubactérienne), on peut se demander alors quel est le sens d’un arbre phylogénétique dans ce contexte (Figure 2.3) (Nelson et al. 1999).
Le deuxième type d’études qui a bouleversé notre vision de l’arbre du vivant est basé sur l’analyse comparative des protéomes. L’observation à la base du problème est que les archaea se groupent à côté des eubactéries en ce qui concerne le métabolisme, mais à côté des eucaryotes si l’on considère les gènes liés à la transcription et à la traduction (Doolittle & Logdson 1998). Ces différences reflètent des problèmes de classification dus au transfert horizontal et aux vitesses différentes de substitution des nucléotides, mais elles reflètent également le fait que l’on esquisse une histoire des gènes et pas vraiment celle des organismes (Tekaia et al. 1999). Ce type de classification présente un aspect simpliste puisqu’il ne prend pas en compte le fait que les génomes ne soient pas des "sacs de gènes" (Huynen & Bork 1998). Les études dédiées à ces questions ne font que débuter, mais il est probable qu’elles changeront profondément notre vision de l’évolution bactérienne dans l’avenir
La dynamique du génome
Par définition le séquençage ne fait que prendre un instantané de l’état du génome. De ce point de vue, il n’est pas étonnant de constater que la plupart des résultats récemment publiés sur la dynamique des génomes sont issues d’études d'électrophorèse et non du séquençage de génomes complets (Kolsto 1997). Néanmoins, la publication de séquences complètes de génomes très proches commence aussi à apporter d’importantes informations dans ce domaine. La structure des génomes bactériens peut être analysée à des niveaux très divers, en incluant la fréquence des oligonucléotides, le contenu G+C, les biais de brin de réplication, l’organisation des gènes, les structures d’opérons, la longueur, le nombre et la géométrie des réplicons, la présence ou l'absence de séquences d’insertion, etc. Comme une bonne partie de cette thèse porte sur ces sujets, nous nous contenterons, pour l’instant, de résumer l’état des connaissances sur ces questions.
La taille des génomes bactériens peut varier considérablement, des 580 kb de Mycoplasma genitalium, jusqu’aux 9.2 Mb de Myxococcus xanthus (Casjens 1998). Cet intervalle de valeurs chevauche celui des plus grands virus (le bacteriophage G mesure 670 kb) et celui des plus petits eucaryotes (les Microsporidiae mesurant moins de 3 Mb). La taille moyenne des gènes des génomes séquencés se situe entre 900 pb et 1 kb, et les gènes occupent environ 90 % du génome. L’exception la plus importante est Rickettsia prowazekii qui présente seulement 74 % de codant (Andersson et al. 1998). La taille du génome est très corrélée au mode de vie des bactéries. Ainsi, les bactéries à plus petit génome sont "spécialistes", typiquement parasites obligatoires, qui ne poussent que dans les hôtes ou dans conditions très spécifiques (Razin et al. 1998) (Andersson & Kurland 1998). Par contre les bactéries à grand génome sont "généralistes", parfois avec des formes élémentaires de différentiation comme la sporulation (Frandsen et al. 1999), la compétence (Lorenz & Wackernagel 1994) ou la formation de micelles (Velicer et al. 1998).
La taille des génomes varie significativement dans un même groupe phylogénétique, par exemple les Spirochaetes varient entre 910 kb et 4.6 Mb et les protéobactéries entre 1.2 Mb et 9.4 Mb (Casjens 1998). De plus, on retrouve dans la même espèce des tailles de génomes très différents. Chez Bacillus cereus, par exemple, la taille du chromosome varie entre 2.4 Mb et 6.3 Mb (Carlson & Kolsto 1994). Chez Escherichia coli on a trouvé des génomes avec des tailles différant de plus de 1 Mb (Bergthorsson & Ochman 1995), l’augmentation correspondant surtout à du transfert horizontal de matériel génétique (Bergthorsson & Ochman 1998).
La découverte que Borrelia burgdorferi avait un chromosome linéaire (Baril et al. 1989), a bouleversé un vieux paradigme de la génétique bactérienne voulant que ces chromosomes soient toujours circulaires (Kolsto 1997). On connaissait déjà des plasmides linéaires chez les Streptomyces et le séquençage de Borrelia burgdorferi a révélé une grande quantité de plasmides linéaires et circulaires (Fraser et al. 1997). La structure des télomères de ces réplicons linéaires suit deux modèles différents. Chez Borrelia, les terminaisons du chromosome sont liées de façon covalente par une épingle à cheveux. Par contre, les télomères des Streptomyces sont ouverts et contiennent des motifs répétés, à l'image des télomères des eucaryotes (Volff & Altenbuchner 1998).
La plupart des bactéries ont un chromosome unique, éventuellement complété par d’autres éléments génétiques comme les plasmides. Néanmoins, on a récemment mis en évidence des familles bactériennes avec plusieurs réplicons de plus de 100 kb (Casjens 1998). Par exemple, six espèces de Brucella ont deux chromosomes de tailles respectives 2.1 Mb et 1.2Mb, les deux portant des gènes essentiels (Michaux et al. 1993). De plus les bactéries ne sont pas strictement haploïdes. Non seulement dans une cellule en croissance exponentielle coexistent plusieurs copies à des étapes différentes de réplication, mais on trouve aussi des bactéries où la polyploïdie est la règle (Casjens 1998). Deinococcus radiodurans possède 4 ou 5 copies de son chromosome qui lui permettent de reconstruire son chromosome après une exposition prolongée à un rayonnement radioactif ou à des périodes de sécheresse extrême (Daly & Minton 1995) (Battista et al. 1999).
Analyse des réseaux métaboliques
Récemment sont apparues des bases de données dédiées à la représentation des connaissances métaboliques et destinées à assister le processus d’annotation (Karp & Riley 1993). Il y a actuellement trois principaux projets de reconstruction semi-automatique de voies métaboliques par l’analyse des génomes, KEGG au Japon (Kanehisa 1997), WIT (Gaasterland & Selkov 1995) et Metacyc (Karp 1996) aux Etats-Unis. Puisque ces projets sont basés sur des concepts similaires, quoique légèrement différents dans le détail et l'implémentation, nous ne décrirons ici que KEGG. Le projet KEGG, qui est l’acronyme de Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes, a pour but l’informatisation de la connaissance actuelle des voies métaboliques et régulatrices. Ces voies sont considérées comme des diagrammes représentant les liaisons entre les gènes, entre les protéines et entre les protéines et les gènes (Kanehisa 1997). KEGG incorpore la carte métabolique de Boehringer et une représentation graphique de plus de 100 voies métaboliques, dessinées manuellement. Tous les gènes d’enzymes sont identifiés par un numéro de code standardisé (EC number). Les voies métaboliques de l’organisme sont générées automatiquement par la mise en correspondance des numéros EC de la banque génomique avec ceux de la banque métabolique (Bono et al. 1998). Ces voies sont construites par l'utilisation comparative du catalogue génomique et des voies de référence. Quand une voie est complète, cette approche renforce les résultats de l’analyse de similarité.
Néanmoins, c’est quand la connaissance est incomplète que la méthode devient vraiment intéressante. Ceci peut arriver quand l'identification fonctionnelle des gènes est erronée. Une autre possibilité est que notre connaissance sur la voie soit insuffisante, ce qui suggère la recherche d’enzymes alternatives qui pourraient réaliser la réaction en question (Bono et al. 1998) (Tomii & Kanehisa 1998). Ainsi, ces outils permettent simultanément la représentation des voies métaboliques, la confirmation des fonctions annotées et la découverte de fonctions ou voies alternatives.
Plusieurs problèmes doivent encore être résolus avant que ces projets n’atteignent leurs buts ultimes qui seraient la modélisation complète du métabolisme, de la régulation génétique et de son évolution. En particulier, il subsiste encore de nombreux trous dans notre connaissance du métabolisme (ce que reflète le grand nombre d’ORFs de fonction inconnue), ainsi que de sa régulation.
Génomique structurale
L’ensemble des protéines codées sur le génome peut être considéré comme une collection de repliements 3D suffisants pour assurer les principales fonctions cellulaires, comme le métabolisme, la réplication ou la gestion de l’information (Frishman & Mewes 1999). Le terme "génomique structurale" a donc été utilisé pour désigner les études de l’ensemble de protéines des génomes, i.e. l’étude du protéome du point de vue de la structure tridimensionnelle. Même si ce thème de recherche a de fortes ressemblances avec l’analyse fonctionnelle in silico, il est rendu beaucoup plus ardu par la difficulté de prédiction de structures tertiaires des protéines. La classification des repliements existants se heurte ainsi à des difficultés diverses, dont, en particulier, l’inexistence d’un consensus sur les archétypes de repliements (Orengo et al. 1994) (Holm & Sander 1996). De plus, sauf dans des cas très particuliers comme les protéines membranaires, la liaison entre les classes de repliement et la fonction de la protéine n'est pas toujours évidente.
La méthode de référence en génomique structurale est le threading. Cette technique est basée sur le fait que les structures tertiaires des protéines sont plus conservées que les structures primaires (Chothia & Lesk 1986). Le threading consiste à essayer de déterminer si une séquence donnée est compatible avec un des repliements connus. Pour comparer une structure linéaire avec une structure tridimensionnelle, il faut que cette dernière soit représentée en termes de la probabilité qu’un aminoacide donné soit présent dans une certaine position du repliement (Bowie et al. 1991). On enfile (to thread) la séquence sur la structure 3D en cherchant à minimiser l'énergie d'interaction de l'ensemble des résidus. Cette énergie d'interaction est le plus souvent calculée par des potentiels statistiques dépendant des distances entre toutes les paires d'acide aminées de la séquence positionnées sur la structure 3D (Sippl & Flockner 1996). En utilisant le threading, Fisher et Eisenberg (Fisher & Eisenberg 1997) ont augmenté de 6 % le nombre de protéines caractérisées structurellement dans le génome complet de Mycoplasma genitalium. Ils ont aussi estimé qu’une augmentation d'un facteur 3 du nombre de protéines de structure 3D connue, permettrait la caractérisation de toutes les protéines solubles de ce génome. Une étude plus récente a conduit à des résultats similaires (Rychlewski et al. 1998). Enfin, une autre étude utilisant la méthode PSI-Blast est arrivée à détecter pour 37 % des protéines de Mycoplasma genitalium au moins un domaine de repliement commun avec une protéine de structure connue (Huynen et al. 1998).
La paillasse après l’analyse in silico
Après l’obtention des génomes et leur analyse préliminaire, il reste encore beaucoup à apprendre sur leurs composants génétiques et surtout sur le fonctionnement général de l’organisme. Deux approches permettent de combler partiellement ces trous dans la connaissance des systèmes génétiques : l’analyse de l’expression génique et la protéomique. Ces deux approches sont complémentaires puisque l'une analyse la partie qui correspond à la transcription et l’autre la partie qui correspond à la traduction (Figure 2.5). Les deux sont des approches qui se veulent à "haut débit", puisqu’il s’agit d’analyser des génomes entiers dans un délai court.
Analyse de l’expression génique à grande échelle
L'analyse quantitative à grande échelle de l’expression génique connaît actuellement un grand bouleversement provoqué par l’arrivée de méthodes capables de détecter simultanément l'expression de dizaines de milliers de gènes différents (Gerhold et al. 1999). L’approche générale est basée sur l’utilisation de matrices d'ADN comme cibles d’hybridation d’une sonde préparée à partir de l'ARNm cellulaire (Figure 2.6). La sonde est produite par transcription reverse de l'ARNm et étiquetage radioactif ou fluorescent. En théorie la technique est quantitative, l'intensité du signal étant une fonction croissante de la quantité d'ARNm présent dans la cellule. La technique permet ainsi la mesure simultanée de l’abondance de chaque espèce présente sur la matrice et en conséquence des niveaux d’expression des gènes correspondants (Granjeaud et al. 1999). En pratique, néanmoins, la quantification soulève de nombreux problèmes.
Il faut que l’hybridation soit réalisée en conditions de grand excès de cible et la mesure de l'information doit être faite en phase initiale d’hybridation. Dans ces conditions la cinétique est approximativement linéaire et autorise la quantification (Nguyen et al. 1995). Pendant l’expérience, seule une petite partie des sondes s'hybride à une cible donnée. Le taux de couverture d'une cible à la fin d'une expérience typique est de l’ordre de 1 % (Granjeaud et al. 1999). En conséquence, les intensités de signal sont assez faibles, ce qui implique l'utilisation de détecteurs très sensibles. Simultanément plusieurs artefacts doivent être éliminés, par exemple l'hybridation non spécifique due à des répétitions ou à des séquences de poly-A (Nguyen et al. 1995).
Il y a actuellement quatre systèmes différents de matrices, qui diffèrent au niveau du matériel, de la sensibilité, de la densité de cibles et du coût. Dans les membranes à haute densité, des colonies d'ADNc sont régulièrement espacées de 1 à 2 mm. La détection est réalisée au moyen de sondes radioactives. Les microarrays de nylon constituent un développement plus récent des membranes à haute densité. En raison de leur petite taille, ils permettent des mesures plus sensibles. Ces deux systèmes sont relativement peu coûteux, mais leur limite de détection est relativement modeste (Granjeaud et al. 1999). Les microarrays de verre constituent probablement le système le plus connu. Dans ce cas, les spots d'ADNc sont déposés sur une lame de verre et hybridés avec des sondes étiquetées par fluorescence (Graves 1999). La haute résolution de la détection optique permet un espacement réduit entre spots (300 mm ou moins). On est ainsi arrivé à placer 5000 gènes/cm2 (Granjeaud et al. 1999), ce qui permet l’analyse d’un grand nombre de gènes en une seule expérience. Les chips d'oligonucléotides contiennent des milliers d'oligonucléotides différents sur un petit chip de verre ou silicium. Les oligonucléotides sont synthétisés in situ par des réactions photochimiques et suivant une technologie de masquage similaire à celle utilisée dans la manufacture des microprocesseurs (Granjeaud et al. 1999). La limite de détection de cette technique est trois fois meilleure que celle des microarrays de verre, cependant elle exige des échantillons et des volumes d’hybridation plus importants.
La protéomique
La protéomique est l’étude de l'ensemble des protéines exprimées dans une cellule à un instant donnée dans le dessein d'obtenir une vision globale des processus cellulaires. Cette thématique est de très grande importance pour déterminer les fonctions des protéines codées par le génome, leurs interactions, et comment leur concentration varie en fonction des conditions environnementales et de développement. Puisque par similarité des séquences, il y a trop de gènes auxquels nous ne savons pas attribuer de fonction, la protéomique complète l'approche in silico. De plus, les relations entre protéines et les phénotypes sont encore trop mal comprises pour être traités exclusivement par l’analyse informatique (Blackstock & Weir 1999).
La protéomique est basée sur l’analyse de gels d’électrophorèse 2D (Figure 2.7), qui constitue la façon la plus performante de séparer des mélanges complexes de protéines. Cette technique est aujourd’hui très reproductible et l’utilisation de colorants fluorescents permet la visualisation et la quantification de milliers de protéines simultanément (Blackstock & Weir 1999). Néanmoins, il reste encore des problèmes importants à résoudre. Les protéines insolubles (comme les protéines membranaires) ne sont pas facilement analysables par cette méthode. En raison du chevauchement des spots, les protéines très exprimées cachent parfois d’autres protéines plus faiblement exprimées. Ainsi, la technique donne encore des résultats modestes pour les protéines présentes à moins de 1000 copies par cellule (Rabilloud et al. 1997). Il a également été suggéré que près d'un quart de tous les spots d’un gel correspondent à des modifications des mêmes protéines, ce qui complique sérieusement l'analyse (Cellis & al 1995). Les logiciels existants sont aussi limitants puisqu’ils demandent de 1 à 8 heures d’édition manuelle par gel (Blackstock & Weir 1999).
Mais le principal problème réside dans l’identification des spots à l’aide des banques d'EST et de la spectrométrie de masse. Le poids moléculaire de la protéine est en soi insuffisant pour permettre l'identification univoque des spots. En conséquence, la plupart des méthodes utilisent une protéolyse préalable et identifient les divers peptides à l’aide d’une analyse simultanée des banques de données et des spectres de masse (Courchesne et al. 1998). C’est probablement dans la liaison entre la spectrométrie de masse et la recherche dans les banques que se feront les plus grandes avancées de cette méthode (Blackstock & Weir 1999).
La protéomique peut être divisée en deux domaines principaux : l’analyse de l’expression des protéines et l’identification de complexes protéiques. L’analyse de l’expression est l’étude des changements globaux d’expression de protéines dans les tissus ou organismes. Joignant le gel 2D et l’analyse d’image cette approche présente l’avantage de déterminer de manière directe l’abondance de la protéine et la détection de modifications post-traductionnelles (Blackstock & Weir 1999). Comme il a été suggéré que la corrélation entre la concentration en ARNm et celle de la protéine associée est en réalité faible (Anderson & Seilhamer 1997), il est souvent préférable de travailler au niveau des protéines, même si l’automatisation des tâches n’est pas aussi avancée que dans le domaine des chips. Par ailleurs, l’identification des interactions ou de la co-localisation cellulaire de protéines associées peut aider significativement à la découverte de la fonction d'une protéine. C’est le but principal de la deuxième thématique de la protéomique, où des techniques comme celle du double hybride joueront probablement un rôle important (Blackstock & Weir 1999).
le site est : http://wwwabi.snv.jussieu.fr/~erocha/webthese/genomique.html
Autres dénominations : Treponema hyodysenteriae, Serpula hyodysenteriae, Serpulina hyodysenteriae.
Voir aussi le fichier : ¤ Brachyspira.
Créé le 25 novembre 1998
Dernière mise à jour le 04 mars 2005
Systématique
La nomenclature de Treponema hyodysenteriae a été proposée en 1972 par Harris et al. pour des souches de spirochètes associées à la dysenterie du porc et capables de reproduire la maladie chez des porcs conventionnels.
En 1979, Kinyon et Harris placent dans l'espèce Treponema innocens des souches isolées du porc et du chien. Ces souches sont non pathogènes, faiblement hémolytiques, non indologènes, elles fermentent le fructose et les hybridations ADN-ADN montrent qu'elles constituent une genomospecies distincte de Treponema hyodysenteriae (pour une définition d'une genomospecies, voir le fichier ¤ "Définitions d'une genomospecies et d'une espèce bactérienne").
Le 01 janvier 1980, Treponema hyodysenteriae et Treponema innocens seront cités dans les Approved Lists of Bacterial Names.
Ultérieurement, plusieurs travaux ont montré que les tréponèmes du porc étaient phylogéniquement distincts des genres Borrelia, ¤ Leptospira, Spirochaeta et Treponema et qu’ils ne pouvaient plus être considérés comme des espèces du genre Treponema.
En 1991, Stanton et al. montrent (i) que les tréponèmes du porc appartiennent bien à l’ordre des ¤ Spirochaetales (présence de la "séquence signature" des spirochètes dans l’ARN 16S) ; (ii) qu’ils constituent deux espèces distinctes mais appartenant à un même genre ; et (iii) qu’ils ne sont pas apparentés au genre Treponema ou aux autres genres constituant l’ordre des ¤ Spirochaetales.
Compte tenu de l’ensemble des données morphologiques, structurales, physiologiques et génétiques, les auteurs proposent de placer ces bactéries dans un nouveau genre qu’ils appellent Serpula puis Serpulina, avec les appellations de Serpulina hyodysenteriae et de Serpulina innocens. Par la suite, le genre Serpulina s’est enrichi de nouvelles espèces, Serpulina pilosicoli, Serpulina intermedia et Serpulina murdochii (voir le fichier ¤ Brachyspira).
En 1997, Ochiai et al. comparent l’intégralité des séquences des gènes codant pour l’ARNr 16S de Brachyspira aalborgi (espèce type du genre ¤ Brachyspira), de Serpulina hyodysenteriae, de Serpulina innocens et de Serpulina pilosicoli, et ces auteurs montrent que les homologies sont supérieures à 96 p. cent. De plus, les valeurs des G + C p. cent, les résultats des hybridations ADN-ADN et les caractères phénotypiques confirment la parenté entre ces bactéries. Au vue de ces résultats, Ochiai et al. proposent de regrouper ces espèces en un unique genre qui compte tenu des règles de priorité doit être appelé ¤ Brachyspira. Les nomenclatures de Brachyspira hyodysenteriae, de ¤ Brachyspira innocens et de ¤ Brachyspira pilosicoli seront validement publiées, le 16 mars 1998, par citation sur la liste de validation n° 64.
Caractères bactériologiques
Brachyspira hyodysenteriae présente la morphologie et la mobilité caractéristiques des espèces du genre ¤ Brachyspira.
Les souches de Brachyspira hyodysenteriae sont constituées par des bactéries spiralées, de 8 à 10 mm de longueur sur 0,3 à 0,4 mm de diamètre, possédant des flagelles insérés à chacune des extrémités de la cellule et se chevauchant au centre (selon les auteurs, le nombre de flagelles varie de 7 à 9 ou de 11 à 14 ou de 7 à 14), donnant une réponse positive aux tests hydrolyse de l’esculine, alpha-glucosidase et bêta-glucosidase, donnant une réponse négative pour l’hydrolyse de l’hippurate et la production d’une alpha-galactosidase.
La production d'indole est un caractère variable selon les souches.
L'étude de la fermentation des sucres nécessite des techniques particulières*. Brachyspira hyodysenteriae fermente le galactose, le glucose, le lactose, le maltose, le mannose, le raffinose et le tréhalose. En revanche, elle ne fermente pas l’adonitol, l’inositol, le rhamnose et le sorbitol. La capacité à fermenter le fructose est variable selon les souches.
La recherche d’activités enzymatiques en galerie API ZYM ou en galerie API AN-IDENT donne un résultat positif pour la phosphatase alcaline, l’estérase C4, l’estérase lipase C8, la phosphatase acide, la bêta-galactosidase, l’alpha-glucosidase et la bêta-glucosidase.
Une croissance optimale est obtenue après incubation dans une atmosphère contenant 99 p. cent d’azote et 1 p. cent d’oxygène. Sur milieux solides, les colonies sont visibles après 48-96 heures d’incubation à 38 °C. La croissance peut être obtenue à 37 ou à 42 °C mais pas à 30 °C.
Après 72 heures d’incubation sur gélose au sang, les colonies sont pâles, translucides, fortement bêta-hémolytiques et d’un diamètre de 5 à 8 mm.
En utilisant des méthodes génétiques (analyse des iso-enzymes, profil de restriction de l’ADN, électrophorèse en champ pulsé,...) et des méthodes phénotypiques (analyse antigénique du LPS-like, analyse des protéines de membrane externe...), il est possible de distinguer plusieurs types de souches au sein de l’espèce Brachyspira hyodysenteriae. Notamment l’analyse antigénique du LPS-like permet de définir des sérogroupes et des sérovars qui sont présentés dans le tableau I. La prévalence des sérovars varie selon les pays et, au sein de chaque sérovar, la virulence semble variable selon les souches.
Habitat et pouvoir pathogène
Classiquement, il était admis que Brachyspira hyodysenteriae avait un spectre d’hôtes étroit, limité au porc, même si cette bactérie est capable d’infecter de manière transitoire et sans symptôme d’autres espèces animales en contact avec des fèces de porcs infectés : rats, souris, chiens, étourneaux.
La souris joue un rôle important dans la contamination des porcs car elle peut se contaminer avec un faible nombre de bactéries (102 unités formant colonies) et elle peut excréter le germe dans ces fèces durant 6 mois. Les autres espèces animales restent porteuses durant un temps plus bref : 13 jours pour le chien, 2 jours pour le rat, 8 heures pour l’étourneau. Les mouches peuvent disséminer des germes viables durant au moins 4 heures.
La survie du germe dans le milieu environnant est parfois considérable : 48 jours dans des fèces de porcs maintenues à une température comprise entre 0 et 10 °C, 61 jours dans des fèces diluées au 1/10 dans de l’eau et stockées à 5 °C. En revanche à des températures plus élevées, le temps de survie dans les fèces diminue considérablement : 7 jours à 25 °C et 24 heures à 37 °C.
En 1992 et en 2004, des souches de Brachyspira hyodysenteriae ont été mises en évidence chez des oiseaux, Rhea americana** (ou nandou d'Amérique) et Anas platyrhynchos (ou canard colvert).
. Dans les élevages de nandous d'Amérique, l'isolement a été effectué chez des oiseaux, âgés de moins de six mois et présentant des lésions de typhlocolite nécrosante. Les principaux signes cliniques consistent en une perte de poids et une diarrhée aqueuse mais, le plus souvent, les animaux meurent sans symptôme préalable et le taux de mortalité peut atteindre 25 à 80 p. cent. À l'autopsie, les caecums sont dilatés, le contenu caecal contient des pseudomembranes et du mucus, la muqueuse caecale est épaissie et elle présente des ulcères. Les souches isolées de nandou d'Amérique sont aptes à reproduire la maladie chez des poulets et des dindes âgées de 1 jour mais les signes cliniques sont moins sévères.
. En 2004, Jansson et al. rapportent l'isolement de sept souches de Brachyspira hyodysenteriae à partir des fèces ou du cloaque de canards colverts. Cinq souches provenaient d'animaux d'élevage et deux souches d'oiseaux sauvages. Aucun signe clinique n'est associé à l'infection et l'inoculation par voie orale d'une souche à des porcs n'a pas permis de déceler un quelconque pouvoir pathogène.
Brachyspira hyodysenteriae est l’agent de la dysenterie porcine (appelée également diarrhée hémorragique ou entérite hémorragique), maladie identifiée dans tous les pays où l’élevage porcin est développé et affectant principalement les porcs en engraissement (mais les truies et les porcelets sevrés peuvent également présenter des signes cliniques).
La dysenterie porcine est une maladie dont les répercussions économiques sont importantes du fait de la mortalité et, surtout, du coût des traitements et des retards de croissance engendrés (l'abattage des animaux peut être retardé de 28 jours).
Le principal mode de contamination d’un élevage résulte de l’introduction d’animaux infectés. Les animaux guéris représentent un danger important car ils peuvent excréter le germe. La durée de l'excrétion est variable : environ 50 p. cent des animaux convalescents restent excréteurs au-delà de 10 jours, 21 p. cent des animaux excrètent le germe au-delà de 18 jours et quelques porcs restent excréteurs au-delà de 70 jours.
D’autres modes de contamination ont été décrits : contamination par des effluents, contamination par des animaux (principalement souris mais aussi chiens et mouches), nourriture contaminée, objets souillés (notamment des bottes)... Les rongeurs, les chiens et dans une moindre mesure les mouches sont incriminés dans le maintien de l’infection après le départ des porcs pour l’abattoir.
Expérimentalement, la dose infectante pour le porc est de l’ordre de 105 unités formant colonies. La période d’incubation varie de 5 à 37 jours avec une moyenne de 11 jours. Durant cette période d’incubation, les animaux peuvent déjà être excréteurs car ils éliminent la bactérie entre 3 et 18 jours après un contact infectant.
La sensibilité des animaux est diminuée par la supplémentation en antibiotiques (aujourd'hui interdite dans de nombreux pays) et par une alimentation générant peu de substrats fermentescibles dans le gros intestin (protéine plus flocons de maïs ou de sorgho cuits à la vapeur ou protéine plus riz cuit). En revanche, elle est exacerbée par de nombreux facteurs : transport, froid, régime alimentaire riche en soja, carence en vitamine E ou en sélénium, présence de bactéries associées (¤ Acetivibrio ethanolgignens, Bacteroides vulgatus, Clostridium sp., Fusobacterium necrophorum, Jonesia denitrificans)... La maladie est également plus grave lors de la première introduction du germe dans un élevage avec un taux de mortalité pouvant atteindre plus de 50 p. cent.
L'expression clinique est variée.
. Dans les cas typiques, l’état général des animaux est d’abord peu modifié, mais ils se nourrissent sans enthousiasme. Quelques animaux développent une diarrhée liquide de couleur très sombre, mais la plupart d'entre eux présente une diarrhée moins liquide, de couleur grisâtre puis devenant plus foncée (couleur chocolat) qui souille le périnée et les flancs. Ultérieurement, les fèces renferment du sang, de la fibrine et du mucus (qui peut donner une apparence brillante aux excréments). Progressivement, les porcs sont abattus, ils maigrissent et peuvent devenir cachectiques. La majorité des animaux guérit en une à deux semaines, mais l’indice de consommation augmente et le GMQ diminue durant parfois plus de 6 semaines.
. Dans les formes plus graves, les animaux sont très affaiblis, ils se déshydratent et meurent en environ 5 jours.
. Les formes subcliniques se manifestent par un retard de croissance.
Les lésions de la dysenterie sont caractéristiques : typhlocolite nécro-hémorragique avec un important dépôt de fibrine puis présence d’ulcères. Le méso-côlon présente un oedème gélatineux et les nœuds lymphatiques sont congestionnés. En revanche l’intestin grêle a un aspect normal. De nombreux spirochètes sont visibles dans les cryptes principalement en début d’infection.
Facteurs de pathogénicité
Chez le porc gnotobiotique, la colonisation de l’intestin et l’apparition de signes cliniques sont favorisées par l’administration de Brachyspira hyodysenteriae associées à d’autres bactéries comme Acetivibrio ethanolgignens, Bacteroides vulgatus, Clostridium sp., Fusobacterium necrophorum, Jonesia denitrificans. En l’absence de ces bactéries associées, l’infection expérimentale demeure possible mais elle nécessite un inoculum plus important. Chez la souris CF1 gnotobiotique, la seule administration de Brachyspira hyodysenteriae conduit à une colonisation et à des troubles cliniques mais l’administration concomitante de Bacteroides vulgatus accroît la sévérité des signes et des lésions.
Les diarrhées observées chez les animaux semblent résulter d’une diminution de l’absorption du colon. Brachyspira hyodysenteriae ne semble pas produire d’entérotoxines car les taux d’AMP cyclique et de GMP cyclique ne sont pas modifiés et la recherche de gènes codant pour des entérotoxines est négative. Les principaux facteurs de pathogénicité impliqués ou probablement impliqués dans la virulence sont présentés ci-dessous.
1 - Mobilité
Les Brachyspira sont mobiles grâce à des endoflagelles, insérés à chacune des extrémités de la cellule, cheminant en direction de l’extrémité opposée et se chevauchant au centre de la cellule. La mobilité se traduit par des mouvements de flexion, de translation et de rotation permettant un déplacement aisé dans un environnement visqueux alors que d’autres bactéries telles que Escherichia coli et Salmonella typhymurium (ou Salmonella Typhimurium) sont immobiles dans un tel environnement. Cette mobilité permet aux bactéries de se déplacer dans la couche de mucus qui recouvre l’épithélium et de coloniser la muqueuse (temps préalable au développement d’une infection). Ces endoflagelles ont une structure générale comparable à celle des flagelles des autres bactéries mais ils sont entourés par une gaine de nature protéique.
Le rôle de la mobilité dans la virulence est bien montré par l’étude de mutants peu ou pas mobiles. Deux types de mutations ont été obtenues : une mutation dans le gène flaA1 (qui code pour une protéine de 44 kDa présente dans la gaine des flagelles) et une mutation dans le gène flaB1 (qui code pour une protéine de 32 kDa présente dans le corpuscule basal). Expérimentalement, ces mutants colonisent mal le caecum de la souris, ne provoquent que peu de lésions et, chez le porc, ils sont incapables d’engendrer les signes cliniques et les lésions de la dysenterie.
Le déplacement des souches sauvages est orienté par des substances chimiotactiques et notamment par la mucine, le L-fucose et la L-sérine qui sont des constituants présents dans le mucus qui recouvre les cellules intestinales.
2 - Adhésion et invasion
Brachyspira hyodysenteriae adhère aux cellules intestinales. Cette adhésion a été étudiée in vitro sur des cellules de Henle (Int-407) et sur des cellules HeLa 229. Elle se fait au niveau de récepteurs de nature saccharidique, elle est inhibée par des immunsérums, par des sérums de porcs convalescents et par des substances contenant de l’acide neuraminique.
Brachyspira hyodysenteriae est parfois présente dans les cellules intestinales et dans la lamina propria mais, in vitro, une pénétration dans les cellules n’a jamais été observée.
3 - Production d’une hémolysine
L’hémolysine est considérée comme un facteur de virulence important. Les souches de Brachyspira hyodysenteriae sont fortement hémolytiques (hémolyse bêta) alors que, sauf exception, les autres espèces du genre Brachyspira sont faiblement hémolytiques. Ces différences dans le degré d’hémolyse pourraient être liées soit à la synthèse d’hémolysines différentes soit à un niveau de production différent. L’effet hémolytique est influencé par la composition du milieu : il est inhibé par le cholestérol et les dérivés du cholestérol ainsi que par certains cations divalents comme le Zn++ et le Cu++. Par contre, les cations Fe++, Mn++, Ni++, Co++ et Ca++ n’ont pas d’effets inhibiteurs.
Comme la streptolysine S, l’hémolysine est insensible à l’oxygène, insensible à l’EDTA, résistante aux pH, sensible à la protéinase K et à la chaleur. Le poids moléculaire de cette toxine est, selon les auteurs, de 19 kDa, de 68 kDa ou de 74 kDa. Ces différences pourraient être liées soit aux méthodes de purification utilisées soit, plus probablement, à l’existence de plusieurs toxines différentes puisque trois gènes tlyA, tlyB et tlyC ont pu être clonés et séquencés. Ces trois gènes sont présents en un seul exemplaire chez toutes les souches de Brachyspira hyodysenteriae alors que des souches de Brachyspira innocens n’hébergent que les gènes tlyB et tlyC.
Les hémolysines de Brachyspira hyodysenteriae sont à la fois hémolytiques et cytotoxiques. Elles n’ont pas d’activité phospholipasique et elles agiraient en provoquant la formation de pores. Cette hypothèse repose sur des expériences consistant à ajouter les hémolysines à des hématies marquées par le 86rubidium. Deux à trois minutes après l’adjonction de ces toxines on constate une libération de 86Rb alors que la libération d’hémoglobine n’est observée que 3 à 7 minutes plus tard. La libération précoce de 86Rb serait liée à la formation des pores qui provoquerait secondairement une entrée d’eau, un gonflement et une lyse des hématies.
In vitro, les hémolysines sont actives sur de nombreux types cellulaires et, in vivo, leur administration dans une anse intestinale de rat ou de porc germ-free produit une érosion des cellules intestinales, des lésions hémorragiques et une inflammation avec infiltration cellulaire de la lamina propria.
Le gène tlyA peut être muté. Les souches mutantes sont peu hémolytiques, elles provoquent peu ou pas de lésions chez la souris ou chez le porc, mais elles sont capables de coloniser l’intestin. Il est intéressant de noter que les porcs inoculés avec de telles souches mutantes sont partiellement protégés vis-à-vis d’une infection par une souche sauvage.
4 - Métabolisme de l’oxygène
Brachyspira hyodysenteriae produit une NADH oxydase qui réduit l’oxygène moléculaire en eau. Cette réduction permet à la bactérie de vivre à proximité d’un tissu qui utilise de l’oxygène, comme l’intestin. L’administration à des porcs de mutants produisant de faibles quantités (de l’ordre de 3 à 5 p. cent de la quantité produite par une bactérie normale) de NADH oxydase diminue le pouvoir infectieux, la sévérité des signes cliniques et les capacités de colonisation de l’intestin.
5 - Système de captation du fer
Le fer est un élément indispensable à la multiplication de nombreuses bactéries. Dans l’organisme, le fer est indisponible car il est lié à la transferrine (dans le sérum) ou à la lactoferrine (dans les sécrétions) et la plupart des bactéries pathogènes ont développé des systèmes de captation du fer. Des souches de Brachyspira hyodysenteriae, appartenant à différents sérogroupes, cultivées dans un milieu carencé en fer expriment au moins trois protéines qui ne sont pas synthétisées lorsque les concentrations en fer sont optimales. Ces protéines ne semblent pas appartenir à des systèmes de sidérophores du type catéchol ou hydroxamate et leurs fonctions sont encore inconnues. Il est intéressant de noter que l'une de ces protéines, d'un poids moléculaire de 109 kDa, antigéniquement homogène chez les 9 souches testées, est exprimée in vivo et elle suscite l’apparition d’anticorps qui pourraient jouer un rôle dans la protection.
6 - Lipopolysaccharide-like
Chez les bactéries à Gram négatif, la membrane externe contient du lipopolysaccharide (LPS). Chez les spirochètes, la structure du LPS est mal connue et on parle de LPS-like (molécule ressemblant au LPS).
L’analyse du LPS-like par électrophorèse et chromatographie en phase gazeuse montre des différences importantes entre le LPS-like des souches virulentes de Brachyspira hyodysenteriae et celui de Brachyspira innocens ou celui des souches non pathogènes de Brachyspira hyodysenteriae.
Le LPS-like partage certaines activités biologiques avec les lipopolysaccharides des entérobactéries : il coagule un lysat d’amoebocytes de limule et son injection est létale pour la souris BALB/cByJ (mais il faut employer des doses deux fois supérieures à celles nécessaires pour tuer une souris avec un LPS classique). En revanche, il est dépourvu d’effet adjuvant, il n’est pas pyrogène et il ne provoque pas de réaction de Shwartzman.
Le LPS-like de Brachyspira hyodysenteriae peut induire la production de TNFα chez la souris et d’IL-1b, d’IL-6 et d’IL-8 chez le porc (ces effets nécessitent des doses plus élevées en comparaison de l’utilisation d’un LPS classique). Rappelons que ces cytokines ont de nombreuses activités biologiques notamment, elles ont un rôle important dans les réactions inflammatoires, elles induisent une fièvre et une anorexie (TNFα, IL-1, IL-6) et le TNFα est toxique pour les endothιliums vasculaires, il induit une nιcrose hémorragique des tissus et une thrombose vasculaire.
Le rôle du LPS-like dans la pathogénie a été démontré par des expériences effectuées sur la souris. Dans cette espèce, les animaux de la lignée C3H/HeJ sont peu sensibles au LPS alors que les animaux de la lignée C3HeB/FeJ sont normalement sensibles. L’inoculation d’une souche de Brachyspira hyodysenteriae à des souris de ces deux lignées est suivie d’une colonisation identique, mais les souris C3HeB/FeJ développent des lésions alors que les souris peu sensibles (C3H/HeJ) n’en présentent pas.
7 - Production de protéases
L’infection de cultures de cellules épithéliales par un grand nombre de Brachyspira hyodysenteriae provoque des altérations cellulaires et un détachement des cellules qui peuvent être inhibés par des inhibiteurs des protéases. La production de protéases a été impliquée dans la virulence d’une espèce de spirochète (Treponema denticola) et des protéases (aminopeptidase, protéase comparable à la trypsine, protéase comparable à la chymotrypsine, sérine protéase) ont été caractérisées chez Brachyspira hyodysenteriae. La sérine protéase, proche de la subtilisine, est une enzyme associée à la membrane externe et qui n’est pas sécrétée. Une telle activité protéasique a également été retrouvée chez ¤ Brachyspira pilosicoli et chez des spirochètes non pathogènes pour le porc (Brachyspira innocens et Treponema succinifaciens) ce qui suggère que les protéases seraient nécessaires pour la survie dans l’intestin. Il est cependant probable que la sérine protéase contribue à la virulence en clivant la mucine de la couche de mucus et en provoquant des altérations cellulaires (dissociation de la barrière formée par les cellules épithéliales, altération des membranes cellulaires, altération de la matrice extracellulaire).
Diagnostic bactériologique
L’examen direct d’un prélèvement de fèces observé au microscope à contraste de phase permet de visualiser des spirochètes mais elle ne permet pas de différencier les espèces pathogènes des espèces saprophytes.
Les spirochètes sont isolés des fèces ou du contenu intestinal ou de la muqueuse du gros intestin. Le prélèvement est constitué soit par des écouvillons placés dans un milieu de transport (les meilleurs milieux de transport sont constitués par un milieu non nutritif, semi-gélosé et contenant du charbon et/ou un agent réducteur) soit par des fèces soit par des fèces dilués dans de l’eau physiologique soit par un raclage de la muqueuse. Les prélèvements doivent être réfrigérés mais pas congelés. Le meilleur prélèvement serait constitué par des selles non diluées et conservées à + 4 °C.
L’isolement nécessite l'utilisation de milieux sélectifs tels que
1) le milieu S400 : gélose trypticase soja au sang + 5 p. cent de sang défibriné de bovin + 400 mg/mL de spectinomycine ;
2) le milieu CVS : gélose trypticase soja au sang + 5 p. cent de sang défibriné de bovin + 100 U/mL de colistine + 25 mg/mL de colistine + 400 mg/mL de spectinomycine ;
3) le milieu BJ : gélose trypticase soja + 5 p. cent d'extrait de fèces de porcs + 5 p. cent de sang défibriné de bovin + 6025 mg/mL de colistine + 6,25 mg/mL de vancomycine + 200 mg/mL de spectinomycine + 25 mg/mL de spiramycine + 12,5 mg/mL de rifampicine ;
4) le milieu BAM : Blood Agar Base n° 2 (Oxoid) + 3g/L d'extraits de viande de boeuf (Difco) + 5 g/L de Bacto Peptone (Difco) + 7 p. cent de sang défibriné de cheval + 400 mg/mL de spectinomycine + 30 mg/mL de rifampicine.
L'isolement peut être précédé par un prétraitement consistant à placer un échantillon de fèces dans un bouillon cœur-cervelle contenant 10 p. cent de sérum fœtal de veau, 400 mg/mL de spectinomycine et 15 mg/mL de rifampicine. Le mélange est agité à l'aide d'un Vortex durant 5 secondes, puis placé à température ambiante durant 30 minutes avant d'être ensemencé sur un milieu sélectif. Le prétraitement des échantillons améliore la sensibilité des cultures.
En revanche, l'utilisation d'une technique de séparation immunomagnétique (billes magnétiques revêtues d'une IgM monoclonale dirigée contre une protéine de membrane externe de 30 kDa) ne permet pas d'augmenter la sensibilité des résultats.
Les boîtes sont incubées dans une atmosphère contenant 94 p. cent d’azote et 6 p. cent de dioxyde de carbone (ou, plus simplement, il est possible d’utiliser un système de type Gas Pak) et à une température comprise entre 37 et 42 °C.
Selon Calderaro et al., les meilleurs résultats sont obtenus en combinant un prétraitement et un isolement sur le milieu BAM. Cette technique permet d'obtenir un culture de Brachyspira hyodysenteriae en 48 heures.
Le degré d’hémolyse est un critère important du diagnostic différentiel (voir tableau II), mais il n’est pas absolu : l’appréciation de l’hémolyse est un caractère subjectif, le degré d’hémolyse peut varier selon la composition du milieu et les conditions de culture, des souches n’appartenant pas à l’espèce Brachyspira hyodysenteriae peuvent être fortement hémolytiques (c’est le cas par exemple de la souche P280)... En théorie, il conviendrait d’utiliser toujours la même technique et de tester en parallèle les souches types de Brachyspira hyodysenteriae (souche B78 = ATCC 27164) et de Brachyspira innocens (B256 = ATCC 29796).
L’ensemencement des boîtes par la méthode dite au scalpel*** permet de mieux visualiser l’hémolyse de Brachyspira hyodysenteriae et elle se révèle plus sensible.
Le diagnostic différentiel des espèces du genre Brachyspira repose également sur l’étude des caractères mentionnés dans le tableau II.
Des anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine de membrane externe, spécifiques de Brachyspira hyodysenteriae et capables de réagir avec toutes les souches, ont été obtenus en 1996 par Lee et Hampson. De tels anticorps, à condition d’être disponibles, pourraient largement faciliter l’identification de Brachyspira hyodysenteriae. De même, il est concevable d’imaginer que de tels anticorps puissent être utilisés dans des tests d’agglutination passive inversée ou dans des tests immunologiques de type sandwich pour détecter des animaux infectés.
Pour pallier les difficultés rencontrées lors de la culture et de l'identification, plusieurs tests de PCR ont été proposés (amplification des gènes codant pour l'ARNr 16S ou pour l'ARNr 23S ou pour la NADH oxydase ou pour l'hémolysine). Ces tests sont généralement effectués sur des cultures car il est difficile d'extraire l'ADN directement à partie des fèces. Toutefois, La et al. ont décrit un test PCR utilisable sur l'ADN extrait des fèces. Ce test amplifie une portion du gène codant pour la NADH oxydase de Brachyspira hyodysenteriae et l'ADN codant pour l'ARNr 16S de ¤ Brachyspira pilosicoli. En moins de 5 heures, il permet d'identifier les animaux infectés par ¤ Brachyspira pilosicoli ou Brachyspira hyodysenteriae ou par les deux germes. Ce test se révèle plus sensible que la culture et tout aussi spécifique.
Les techniques de diagnostic indirect par mise en évidence d’anticorps (ELISA, hémagglutination indirecte, hémolyse passive, micro-agglutination...) sont parfois utilisées pour détecter des élevages infectés par Brachyspira hyodysenteriae, mais elles ne permettent ni un diagnostic individuel ni la détection des animaux porteurs. Le principal problème rencontré dans le diagnostic indirect est la présence de communautés antigéniques entre les différents spirochètes intestinaux, ce qui conduit à des réactions faussement positives.
Sensibilité aux antibiotiques
La recherche de la sensibilité in vitro aux antibiotiques fait généralement appel à des méthodes de dilution en milieu gélosé ou en milieu liquide. La technique de dilution en milieu liquide est de réalisation plus simple et elle donne des résultats plus faciles à lire.
La majorité des souches est sensible au carbadox, à l'olaquindox, au dimétridazole, à l'efrotomycine, à la valnémuline, aux pénicillines, au chloramphénicol, aux tétracyclines et à la streptomycine.
Une tendance vers une augmentation de la résistance est notée pour la tiamuline, les macrolides (dont l'érythromycine et la tylosine) et les lincosamides (dont la clindamycine et la lincomycine).
. La résistance à la tylosine peut concerner jusqu'à 66 p. cent des isolats et ces souches sont également résistantes à l'érythromycine et à la clindamycine. Cette résistance est due à une mutation ponctuelle du gène codant pour l'ARNr 23S.
. La résistance à la tiamuline, observée dans de nombreux pays (Allemagne, Hongrie, République Tchèque, Royaume Uni), est associée à des mutations touchant la protéine ribosomale L3 et l'ARNr 23S.
Le traitement par administration parentérale d’antibiotiques est une excellente méthode pour obtenir rapidement une guérison clinique. Toutefois, elle représente une charge de travail importante dans les grands élevages et on peut lui substituer un traitement par voie orale grâce à l’adjonction d’antibiotiques dans la nourriture ou, mieux, dans l’eau de boisson (dans les phases aiguës de la maladie, les porcs mangent moins mais continuent à s’abreuver normalement).
La tiamuline, la tylosine et la lincomycine sont des antibiotiques largement utilisés pour un traitement effectué dans l’eau de boisson. L'augmentation de la résistance à ces molécules, résultant d'une mauvaise utilisation des ces antibiotiques (traitements prolongés ou à doses insuffisantes), est particulièrement préoccupante.
Prophylaxie
Le type d’immunité (immunité locale ou systémique, immunité à médiation humorale ou cellulaire) impliqué dans une éventuelle protection est encore inconnu . Toutefois, les animaux convalescents sont partiellement protégés (protection le plus souvent spécifique de sérovars) vis-à-vis d’une nouvelle infection ce qui indique que la vaccination pourrait être un moyen de prévention efficace. Actuellement, aucun vaccin ne s’est révélé très efficace et/ou d’utilisation simple (à titre d’exemple, la vaccination avec une souche tuée par le formol nécessite 6 injections par voie intraveineuse !) et/ou d’un usage sûr (un vaccin inactivé et adjuvé par une huile minérale a même conduit à une exacerbation des signes cliniques après une épreuve expérimentale) si bien qu’aucun vaccin n’est actuellement commercialisé en France.
Les espoirs reposent sur l’utilisation des souches mutées sur le gène tlyA et sur l'utilisation de vaccins recombinants (expression dans une souche de Escherichia coli d'une protéine de membrane externe de 29,7 kDa).
La prophylaxie repose sur des mesures sanitaires (contrôle des animaux importés dans l’élevage, limitation des visites, lutte contre les rongeurs, nettoyage, désinfection, vide sanitaire...) qui sont à la base de tous les programmes de prévention.
Orientation bibliographique
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